Quando Chuck Bartowski abre um e-mail com códigos referentes a segredos do governo americano, ele inconscientemente faz o "download" de toda uma base de dados sigilosos para o seu cérebro. Agora, o destino do mundo está nas mãos de um jovem que trabalha numa loja de computadores. Em vez de combater vírus de computador, ele vai ter de confrontar assassinos e terroristas internacionais.

A segunda temporada continua focada na luta constante de Chuck para manter sua vida de espião e vida real à medida que ele se torna mais acostumado a ser um espião. Mais informações sobre o projeto Intersetorial são reveladas. O Fulcrum, uma organização de espionagem hostil que cobiça o Intersetorial, é mais fortemente considerado o principal antagonista da temporada. Chuck e Sarah continuam se aproximando, complicando o relacionamento entre os ativos.